Las proteínas de la leche
1.
INTRODUCCIÓN
Las proteínas de la leche son las proteínas animales que
desde hace más tiempo y en mayor
cantidad consume el hombre (8). Así mismo, debido a la facilidad con que se les puede aislar de la leche
cruda, también son las proteínas mejor
estudiadas e incluso se conoce la estructura primaria de su casi totalidad.
Pero como estas proteínas presentan una gran diversidad de estructuras y
propiedades físico-químicas y existen grandes variaciones entre especies, su descripción comparativa es muy
complicada. La leche de vaca (Bos taurus)
es la mejor conocida; su producción es la más importante, porque se utiliza para reemplazar la leche
materna y como alimento proteico esencial
de los adultos. Además la leche y sus derivados, entran en la composición de numerosos alimentos domésticos
o industriales y esta tendencia sigue
aumentando. Asimismo, este sector se benefició del desarrollo de nuevas técnicas de fraccionamiento y
transformación que mejoraron considerablemente las condiciones del consumo,
conservación o incorporación.
Numerosas citas bibliográficas recientes, confirman la importancia de los estudios realizados sobre las
proteínas de la leche (2, 1 1, 13, 16, 28,29, 30, 42, 43, 49).
Los resultados de estos trabajos potencian el interés que actualmente suscitan las proteínas de la leche en el plano
nutricional, biológico y tecnológico. En fin, no olvidemos que la producción
lechera y sus industrias derivadas,
representan el sector más importante de la economía agro-alimentaria en Francia y Mercado Común Europeo.
2.
COMPOSICIÓN DE LAS PROTEÍNAS DE LA LECHE DE VACA
2.1.
Composición global de la fracción proteica
En una leche normal el contenido
medio de proteínas es de 30-35 g
por litro, lo que
representa el 95% del nitrógeno total de la leche. En torno al
80°/o de las proteínas, se encuentran bajo la forma de
complejos macromoleculares, conteniendo una parte mineral
(especialmente fosfato de calcio) que se conocen bajo el nombre
de núcelas. Las
caseínas están presentes fundamentalmente en esta forma y contienen
hasta un 8°/o de constituyentes minerales
(43). Entre estos últimos el calcio micelar representa el 27°/o del
calcio total de la leche, con una concentración de 1,2 g/1 (30 mM). Las caseínas, a causa de su estructura macromolecular tan
particular, son fácilmente aislables
por centrifugación o precipitación isoeléctrica a pH 4,6. La
fracción no sedimentable,
llamada "proteínas solubles" o "proteínas de lactosuero'* está constituida por proteínas
globulares tales como la /3-lactoglobulina, a-lactoalbúmina, inmunoglobulinas, etc.
Gracias a los
avances realizados en el fraccionamiento de proteínas, ya se identificó en la leche un alto número de proteínas
individualizadas; sus cadenas peptídicas, cuya síntesis en la glándula mamaria está
programada por un gen característico, pertenecen
a seis grupos principales: 4 para las caseínas (asl,«s2> 0, *) y 2 para las proteínas
solubles (/3-lactoglobulina, a-lactoarbúmina). La síntesis proteica sobre los ribosomas
viene seguida por modificaciones post-traslacionales, tales como
la fosforilización y glicosilación.
2.2. Heterogeneidad
Si las proteínas de la leche se someten a un fraccionamiento
electroforé-tico (sobre gel de
almidón o de poliacrilamida), en presencia de un agente disociante (urea) o reductor (2-mercatoetanol), se
pueden identificar varias fracciones. En
efecto, algunas proteínas pueden tener varios niveles de fosforilización (caseína as2) o de
glicosilización (caseína x )';'además todas estas proteínas presentan un poliformismo genético y
las variaciones genéticas de la 0-Iactoglobulina
son las que se conocen desde hace más tiempo. Usualmcnte, al igual que las otras proteínas, sólo
difieren en la sustitución de uno o varios
residuos de aminoácidos en la secuencia pcptídica. En la actualidad se conocen cuatro variantes para la
caseína asl (A. B, C. D) y la
caseína as2 (A, B, C, D), ocho para la caseína j3 (a! , A2 , A3, B,
B2, C, D, E), dos para la
a-lactoalbúmina (A, B) y seis para la j3-lactoglobulina (A, adr, B, bdr,
C, D). En efecto, el examen de la estructura y de la filiación de las diferentes formas polimorfas de las
caseínas indica una ligazón estrecha
entre los cuatro locus de los genes para la síntesis de esas proteínas. Así, no se observan con idéntica frecuencia
las proteínas dotadas de cuatro
genes; las caseínas as] B y as2 A, las caseínas (JA y (3A2
aparecen más frecuentemente que las
otras variantes. Al contrario, las variantes A y B de la caseína k y de
la 0-lactoglobulina tienen frecuencias idénticas. En fin, algunas variantes son muy raras, pues sólo
se presentan en la leche de ciertas especies (caseína así A
en la leche de la raza Frisona Holstein, (3-lactoglobulina
adr y bdr en 'a leche de la rarza
australiana Drought-master).
2.3. Composición de los diferentes constituyentes
2.3.1. Comjjosición de la caseínas
Son proteínas acidas, por
ser ricas en ácido glutámico y aspártico: en la caseína B el contenido en prolina es acusadamente
alto; este aminoácido está repartido bastante regularmente a lo largo de la
cadena peptídica, lo que hace improbable
la presencia de estructuras ordenadas (hélice a o estructuras /3) en cantidades apreciables. Otros
constituyentes como la caseína asl y la caseína (3 no poseen
cisteína, mientras que la caseína as2 y sus derivados, así como la caseína k contienen dos residuos por molécula.
La composición en aminoácidos de las caseínas, le confiere una
hidrofo-bicidad media, ligeramente superior a la de la mayoría de las proteínas
globulares; esta propiedad le permite a las caseínas asociarse muy fácilmente en complejos de elevada masa molar.
Una de las características esenciales de las caseínas, es el resultado
de las modificaciones
post-translacionales; en efecto, todas las caseínas se fosfo-rilizan con
intensidad variable al nivel de los residuos deserina y de treoni-na (con excepción para un residuo fosfotreonil) en
la caseína asl A). Así los
constituyentes asl ,B,(3AyKAoB contienen respectivamente 8, 5 y 1 residuos
fosfoseril. La familia de las caseínas as2 a muestra una gran variabilidad
de niveles de fosforilización (10a
13 residuos fosforil por molécula) que
tanto pueden proceder de la variabilidad de la actividad de fosfo-quinasas,
corno de las fosfatasas. Las serinas se fosforilizan a nivel de sitios específicos definidos por secuencias codificadas.
La caseína k contiene
una parte glucídica compuesta de galactosa, N-acetilgalactosamina y ácido
N-acetilneuramínico. La caseína k del
calostro contiene además
glucosamina.
Algunas caseínas (ti ,
7j, 73) resultan de una proteolisis post-translacio-nal de la caseína 0 debida,
probablemente, a la acción de mínimas cantidades de plasmina de origen sanguíneo. Las
proteoso-pectonas encontradas en la fracción
soluble constituyen la parte peptídica complementaria resultante de esta proteolisis limitada.
El conocimiento de las características estructurales de las proteínas "de la leche permite prever un cierto número de sus
propiedades físicas y físico-químicas;
así algunos valores calculados están de acuerdo con los datos experimentales . Por ej., la carga de
la caseína a pH 6,6 (pH normal de la
leche), calculado según su composición de aminoácidos, fosforo y glúcidos, resulta perfectamente comprobado
por electroforesis o por las curvas de
valoración ácido-base. Sin embargo, la carga de las caseínas en la leche, puede ser modificada por la
fijación de iones como el calcio; aún es más, la
única glicoproteína, la caseína k ,
puede resultar más o menos cargada según
su contenido en ácido N-acetil-neuramínico. En efecto, cada trisacárido (657 daltons) o tetrasacárido
(948 daltons) aporta una carga negativa y
modifica la masa molar (MM de 2.188, para la caseína k j\ poseyendo 3 cadenas
trisacarídicas
Asimismo, desde el punto de
vista isoiónico los valores
experimentales de las caseínas
resultan muy próximos a los que se calculan según la composición química; esto indica que todos los grupos
ionizados de las caseínas son accesibles,
pues no hay ningún valor anormal de constante de disociación. Pueden hacerse las mismas observaciones a
propósito de los valores de volumen específico y de absorción específica a 280
nm.
2.3.2. Composición de las proteínas del lactosuero
La glándula
mamaria sintetiza las dos proteínas principales del lactosuero: la (3-Jiactoglobulina y la a-lactoalbúmina
que,contrariamente a las caseínas, no sufren modificaciones
post-translacionales, aunque poseen (/3-lacto-globulina, por ej.) sitios potenciales de
fosforilización.
Su composición en aminoácidos es muy diferente de las caseínas:
contiene menos ácido
glutámico y prolina pero son más ricas en aminoácidos azufrados (cisterna y metionina). Además, la
a-lactoalbúmina contiene importantes
cantidades de triptófano.
Según
Jas curvas de valoración ácido-base de la 0-lactoglobulina, parece que las 3
variantes tienen 2 grupos 13 y y COOH donde el pKy^ de ionización
está modificado; además, la variante C contiene residuos histidil no valorables (2 por di'mero) entre pH 6 y 4,5. Estas
observaciones indican que la molécula
sufre modificaciones en su conformación cuando varía el pH, lo que presupone una estructura compacta,
globular, establecen la cual están incluidos los
grupos ionizados y pierden sus características propias.
Un estudio similar sobre la a-lactoalbúmina, también indica anomalías en la curva de valoración. Según el cuadro 3, el pH
isoiónico calculado de la a-lactoalbúmina B no corresponde al valor
experimental.
Las proteínas de origen sanguíneo (seroalbúmma,
inmunoglobulinas) están presentes en pequeñas cantidades en la fracción soluble
de la leche humana o del calostro.
A veces su contenido es elevado. El lactosuero también contiene una fracción peptídica formada por las
proteaso-peptonas (compuestos 5 y 8-
de migración electroforética rápida, compuesto 8 "lento"). Como se descubrió recientemente
provienen de una proteolisis limitada de la caseína 0 y aquí se estudiarán al
mismo tiempo que su estructura
2.4. Proteínas de la leche de
otras especies de mamíferos
Las importantes variaciones de
composición que hay entre las
diferentes especies de
mamíferos afectan tanto a la proporción como a la naturaleza de las proteínas:
así, el contenido en protcína varía de menos de 10 g/1 en la leche de mujer a unos 200 g/1 en la de coneja.
Las leches de mamíferos pueden clasificarse
en dos grupos, según la naturaleza de las proteínas que contienen:
. Las leches de mamíferos poligás trieos (rumiantes); las diferencias entre las especies son poco importantes, porque la caseína
es la proteína dominante (74 a 80% del nitrógeno
total). Estas leches tienen un pH ligeramente ácido (pH 6,3 a 6,8), son coagulables porque
tienen la caseína k que es el substrato de proteasas coagulantes
específicas. Parece que todas estas leches
contienen la (J-lactogiobulina y la a-lactoalbúmina.
. Las leches de mamíferos monogástricas. Las proteínas solubles están en mayor proporción que en las leches de rumiantes.
La caseína se presenta en proporciones
muy variables (30 a 70%). Muchas de estas leches
tienen una reacción ligeramente alcalina y son difíciles de coagular
con el cuajo (presencia no sistemática de
caseína k). Frecuentemente, la 0-lacto-globulina está ausente (salvo para la de camella,
burra y yegua). En la leche humana
está en cantidad ínfima, aunque se pudo aislar una proteína que reacciona con un suero anti-(3-lactoglobulina (13), la
a-lactoalbúmina es el constituyente
principal del suero. que compara las proteínas de leche de mujer
y vaca, resume bien estas observaciones.
3.3
ESTRUCTURAS PRIMARIAS, CONFORMACIÓN Y PROPIEDADES FÍSICO-QUÍMICAS DE LOS MONOMEROS
El conocimiento de la secuencia de los aminoácidos de las diferentes proteínas de la leche, suministró una gran
información sobre las características
estructurales y permitió calcular (en asociación con técnicas físicas tales
como la difracción de rayos X) o bien prever las estructuras tridimensionales. Estas son las que permitieron
comprender mejor las propiedades físico-químicas y funcionales de los
diferentes constituyentes proteicos de la leche.
3.1. Caseínas
3.1.1. Caseínas a
Al igual que para las otras caseínas, la localización de las cargas y de las cadenas laterales hidrófobas es muy irregular. Esto
confiere a la molécula un comportamiento
dipolar con un polo globular mucho más hidrófobo y un polo cargado; se pueden establecer así tres
trozos hidrófobos, comprendidos entre los
residuos 1 -44, 30-11 3 y 1 32-1 99 y una parte muy fosfonla-da (residuos 41-80), que representa la casi
totalidad de la carga negativa (-20,6) a pH 6,6:
en esa región se nota también la presencia de un 9° grupo ortofosfato en la caseína aso y asl
D.
Varias partes de secuencias presentan homologías con las secuencias parciales de otras caseínas:
- Parte hidrófoba 25-39 que recuerda a la de 83-1 00 de la
caseína 0
- Parte cargada 62-70
que contiene residuos fosfoseril parecidos a la par
te 13-21 de la caseína (3 o a la parte 7-1 2 y 55-60 de la caseína as2.
te 13-21 de la caseína (3 o a la parte 7-1 2 y 55-60 de la caseína as2.
3.1.2. Caseína a^
Es la más hidrófila de todas las caseínas (hidrofobicidad
próxima a las proteínas
globulares) porque es la más fosforilizada (10 a 13 residuos fos-foseril/mol) y la más rica en residuos catiónicos.
Los residuos fosfoseril están agrupados en
tres polos (residuos 8-16, 56-61 y 129-133) mientras que las partes hidrófobas se limitan a las porciones
160-207 (secuencia C terminal) y 90-120 (secuencia central). Esta estructura
sugiere que las interacciones
electrostáticas son muy importantes y dependen del pH; resulta así
una gran sensibilidad a los iones Cá1*.
3.1.3. Caseína 0
Es la más hidrófoba de las caseínas; las partes fuertemente
cargadas están separadas por un trozo muy largo hidrófobo; así la parte N
terminal , que
contiene 4 de los 5 átomos de fósforo tiene una carta neta de -12 a pH 6,6 mientras que la parte hidrófoba no está
cargada. La molécula presenta
un carácter anfipolar muy marcado: parte N terminal muy polar (1/3 de la molécula) y
parte C terminal hidrófoba conteniendo las 2/3 restantes de la molécula. El alto contenido
En residuos prolil regularmente repartidos
presupone una estructura poco ordenada. En efecto, los trabajos más recientes indican que la caseína/3
contiene 10% de hélice a (97-103.
138-146), 13% de pliegue (3 (52-60,77-87, 187-195) y 77% de estructura no ordenada (sin orden estadístico).
El comportamiento
de la caseína /J frente a las
proteasas, difiere según que la molécula se
encuentre bajo la forma de mónómero o incluso en la de micela. En la micela, la caseína asi
es más susceptible a la hidrólisis por
proteasas, tales como la pepsina, tripsina o plasmina que la caseína /3. Sin embargo, a baja temperatura (4"C), la
caseína 0 puede perder la estructura micelar y llegar a ser más sensible a la
acción de las proteasas (3). Así, las caseínas 7 provienen de la parte C
terminal de la caseína /3 mientras que el complemento (parte N terminal) está constituida
de varias proteasas-
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